Le rôle de la gîte dans l'extraction de l'adn

Quel est GTE utilisé pour?

• GTE est utilisé pour remettre en suspension les culots de cellules bactériennes avant la lyse (rupture ouverte) récolte des cellules et l'ADN de plasmide à l'intérieur. Le lysozyme, ce qui adoucit les membranes cellulaires, est souvent ajouté avec le tampon GTE. La réalisation d'une suspension homogène de cellules entières au cours de cette étape de façon que la solution de lyse ensuite ajoutée peut accéder à la totalité des cellules est essentiel pour obtenir de bons rendements d'ADN. GTE est conçue pour ce faire, tout en offrant un environnement stable pour l'ADN.

Glucose pour osmolarité

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  50 mM (millimolaire) de sucre glucose est ajouté à un tampon pour maintenir l'osmolarité GTE où la concentration du soluté à l'extérieur des cellules est proche de celle à l'intérieur des cellules. Cela empêche la lyse cellulaire prématurée, ce qui peut provoquer des rendements d'ADN inférieures à cause de l'agrégation et de la dégradation. Les autres composants du tampon contribuent également à l'osmolarité de la solution, mais le glucose, qui est un non-électrolyte, est un bon choix car il ne perturbe pas les propriétés de la solution tampon.

Tris de stabilité du pH

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  Tris est le nom court pour le tris (hydroxyméthyl) aminométhane, qui est un tampon de pH très commun. Dans le cas du tampon GTE, le sel d'acide (Tris-HCl) est ajouté à la mémoire tampon à une concentration de 25 mM. Cela permet de maintenir le pH de la solution à un quasi-physiologique de 8,0, un pH idéal pour empêcher l'hydrolyse de l'acide (dégradation) de l'ADN plasmidique et des réactions secondaires indésirables des autres composants cellulaires.

EDTA Empêche la dégradation de l'ADN

• EDTA ou acide éthylène, capture ou "chélates" des ions métalliques dans la solution, les empêchant de participer à des réactions secondaires indésirables. En GTE tampon, EDTA est ajouté à 10 mM. Son but principal est dans le tampon d'arrondir zinc libre, le magnésium et le calcium, empêchant ainsi la dégradation de l'ADN par certaines voies qui nécessitent ces métaux.

Quelques conseils importants

• Gardez votre tampon GTE froid et faire en petites quantités pour empêcher la croissance de bactéries non désirées chez elle. Le sucre et le pH contrôlé en font un milieu de croissance grande. Toujours utiliser de l'eau purifiée. L'eau du robinet peut avoir un excès d'ions métalliques à partir de la tuyauterie, ce qui peut submerger la capacité de l'EDTA à capturer. Si vous soupçonnez la présence d'ARN interférant dans votre échantillon, ajouter RNase A à 100 microgrammes par millilitre à votre tampon GTE pour éliminer le problème.