Quel est l'électrophorèse sur gel?

La Préparation Des Échantillons

• Quand un détergent tel que le dodécylsulfonate de sodium (SDS) est ajouté à une protéine ou un acide nucléique, le détergent va associer à déplier et protéines dénaturées) (et de l'acide nucléique. La dénaturation des protéines, il est plus facile de déterminer leur poids moléculaire dans une électrophorèse. La quantité de l'échantillon nécessaire est typiquement de 100 à 500 nanogrammes par bande d'échantillon de protéines et de 5 à 100 ng par bande pour les acides nucléiques dans un volume total d'environ 25 à 40 microlitres.

Gels

• 
  
  
  

  Un gel, typiquement en polyacrylamide ou agarose, peut être préparé ou acheté pour séparer ces protéines. Le gel est un peu comme la gélatine. Il est principalement de l'eau, mais il est suffisamment solide pour la manipulation. Les gels contient le tampon pour contrôler le pH. Le gel est très mince (1 à 2 mm) et rectangulaire. Un côté ressemble à un peigne avec beaucoup de dents manquantes. Les écarts sont appelés puits.

Exemple de chargement

• On place le gel dans une chambre avec un tampon et les protéines dénaturées sont ajoutés dans les puits. Des échantillons de poids moléculaires connus sont ajoutés dans les puits extérieurs. Les gels sont faites avec des quantités variables de polyacrylamide. Une faible résistance de gel (4 pour cent) est préférable pour la séparation de molécules de poids moléculaire élevé, tandis qu'une résistance de gel élevée (12 pour cent) est utilisé pour les molécules de poids moléculaire supérieur. Un gel de gradient varie en force de gel permet de séparer et une large gamme de protéines avec la perte d'une partie de résolution.

Electromigration

• 
  
  
  
  

  Avec l'application d'une tension électrique élevée, les protéines dénaturées se déplacent vers le fond du puits. Plus le poids de la protéine, le plus lent se déplace. Lorsque l'électricité est coupée, les protéines arrêtent de bouger. On enlève le gel de la chambre et de roches dans un plat avec de la teinture. Colorants organiques tels que le bleu de Coomassie ou métalliques colorants sont utilisés pour colorer les protéines tandis que les colorants fluorescents tels que le bromure d'éthidium sont utilisées pour les acides nucléiques.

Analyse des résultats

• Avec la suppression de l'excès de colorant, on peut voir que les mélanges se séparent en bandes qui ressemblent à des échelles. La position des bandes est comparée à la distance parcourue par les normes pour déterminer le poids moléculaire de l'échantillon dans chaque bande. Le gel peut être déshydraté avec de l'alcool et séché de sorte qu'il peut être sauvé. L'intensité de la couleur de la bande peut alors être mesurée pour déterminer la concentration de la protéine dans chaque bande.

Protocole développement

• Protocoles standard sont disponibles pour travailler avec des protéines connues. Si un chercheur travaille avec un échantillon inconnu, la force du gel, le type de mémoire tampon, un tampon pH, la tension, le temps de fonctionner, et les taches peuvent tous besoin d'être optimisé pour obtenir la meilleure séparation et le signal.

Protocoles